Pre-mRNA（前體 mRNA）剪接是去除非編碼的內含子序列的重要步驟，是真核生物基因表達的關鍵環節。這一過程由剪接體參與完成，剪接體分為主要剪接體（major spliceosome）和次要剪接體（minor spliceosome）。其中，主要剪接體負責去除 99.5% 的內含子，而次要剪接體負責處理剩餘的 0.5%。
剪接體的異常與許多疾病息息相關，主要是癌症和罕見病。在過去的研究中發現，大多數 RNA 剪接失調的已知癌症源性突變影響 SF3B1 的 HEAT 重複序列中的殘基。這些突變絕大多數聚集在 SF3B1 的 RNA 通路上，SF3B1 在酵母中的同源物 Hsh155 的相應部分突變改變了其與 Prp5 的相互作用和分支位點（Branch site, BS）選擇。
儘管已經了解到這些線索，但這些癌症突變如何幹擾正常的剪接仍然是謎。要解決這些關鍵問題，就必須從結構上闡明導致剪接體 A 複合物形成的剪接體複合物中間體。
2024 年 1 月 9 日，西湖大學施一公團隊和中國科學技術大學張曉峰團隊合作在Nature Structural & Molecular Biology雜誌上發表了題為：Structural Insights into Branch Site Proofreading by Human Spliceosome的最新研究。
在這項研究中，他們報告了人類 17S U2 snRNP 和剪接體 pre-A 複合體的高解析度低溫電子顯微鏡 (cryo-EM) 結構。基於結構的生化分析，研究團隊提出了一個關於 BS 選擇校對和 A 複合物組裝的工作模型。
圖片來源：Nature Structural & Molecular Biology
研究內容
由於 PRP5 是 U2 snRNP 的重要組成部分，研究團隊使用 Flag 標記的 PRP5 來純化內源性的人 17S U2 snRNP，並重建了平均解析度為 2.5 Å的 17S U2 snRNP 電鏡結構。
隨後，為了富集中間剪接體複合物，研究團隊使用了抑制劑 spliceostatin A（SSA），該抑制劑能夠在 A 複合物形成之前阻止剪接。結果顯示存在一個雙葉狀的剪接體複合體（pre-A 複合體），包括 U1 snRNPs 和 U2 snRNPs。最終重建的人 pre-A 複合體 U2 snRNP 區域的平均解析度為 3.0Å。17S U2 snRNP 和 pre-A 複合體的 EM 圖譜揭示了許多功能十分重要但以前未被識別的特徵。
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通過對 PRP5 和 SF3B1 之間的界面進行原子建模，他們發現 PRP5 N 端的三個結構基序與 SF3B1 緊密結合，將 PRP5 與 U2 snRNP 連接。三個結構基序包括一個長螺旋 α1、一個 acidic loop 和一個螺旋 α2。
其中，PRP5-SF3B1 界面最顯著的特徵是 PRP5 acidic loop 結合在 SF3B1 的 RNA 通道中，這是 pre-mRNA 的多聚嘧啶區（polypyrimidine tract, PPT）在組裝剪接體中的結合位置。PRP5 acidic loop 在 RNA 通道中的結合必須由組裝的剪接體中 pre-mRNA 的 PPT 替換。由此，PRP5 可能起到阻止 RNA 通道在剪接體組裝之前結合非特異性 RNA 的作用。
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人 pre-A 複合物呈雙葉狀結構，U2 snRNP 與 U1 snRNP 之間通過柔性連接。與 17S U2 snRNP 相比，pre-A 複合物中 U2 snRNA 的構象以及周圍蛋白質由於與 pre-mRNA 的結合發生了顯著重排。與其他靶向 SF3B1 的抑制劑一樣，抑制劑 spliceostatin A（SSA）嵌入在 SF3B1 和 PHF5A 之間的鉸鏈口袋中。
在組裝的剪接體中，從延長的 U2–BS 雙鏈中翻轉出的 BPA（branch-point adenosine）被 SF3B1 和 PHF5A 之間的鉸鏈口袋特異性識別。然而，在獲得的 pre-A 複合體中，SSA 佔據了鉸鏈口袋，使得 BPA 無法進入。因此，BPA 周圍的 4 個核苷酸只在組裝的剪接體中與 U2 snRNP 形成雙鏈，但在 pre-A 複合體中並沒有觀察到。這一分析強烈表明，BPA 識別和穩定的延長的的 U2-BS 雙鏈的形成之間存在相互關聯。
圖片來源：Nature Structural & Molecular Biology
在組裝 A 複合物的過程中，17S U2 snRNP 通過與 SF1 的相互作用被帶到 BS 附近。然而，由於 TAT-SF1 的保護作用，pre-mRNA 無法獲得 BSL。在 ATP 結合和水解的驅動下，PRP5 可能會拉動 U2 snRNA 的 5 ‘ 端，解開雙鏈 BSL，從而干擾其與 TAT-SF1 的相互作用。打開的 BSL 序列依次與 BS 配對，形成初始的 U2-BS 雙工。在這種中間狀態下，SF1 尚未與 BS 完全分離。
相反，它與初始的 U2–BS 雙鏈一起與 SF3A3、SF3A2-ZnF 和 PRP5 的解螺旋酶結構域結合。DNAJC8 與 SF3B1 在鉸鏈袋的另一側特異性相互作用。雖然 PRP5 校對 BS 的機制仍不清楚，但這一 17S U2 snRNP 和 pre-A 複合體的結構表明，PRP5 通過競爭機制校對初始 U2-BS 雙鏈。在 pre-A 複合體中，PRP5 的解旋酶結構域與初始的 U2-BS 雙鏈緊密相互作用，而 PRP5 的 acidic loop 佔據了 RNA 通路，使得 pre-mRNA 無法進入。包含最優 BS 的初始 U2-BS 雙鏈不太可能被 PRP5 破壞穩定，從而使下游 PPT 和 3’SS 序列有更好的機會從 RNA 通道競爭 PRP5 的 acidic loop，最終導致 PRP5 解離。隨著 PRP5 的釋放，BPA 與鉸鏈口袋對接，SF3B1 變成閉合構象。
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癌症相關的突變已在許多剪接體組分中被發現，特別是 SF3B1。這些突變聚集在 RNA 通路及其周圍區域，與 SF3B1 上的 PRP5 結合位點重合。在 RNA 通路中，Asp781 在髓系發育不良症候群中發生了反覆突變。Arg625、His662、Lys666 和 Lys700 均通過氫鍵與 acidic loop 直接相互作用，它們在髓系發育不良症候群和慢性淋巴細胞白血病中均有高頻率突變。
為了探究這些突變的影響，研究團隊進行了基於結構的生化分析。結果顯示，與 WT SF3B1 相比，突變 K700E 導致 SF3B1 和 PRP5 的相對結合比率從 100% 降低到 64%。類似的，RNA 通道中的其他七種癌症衍生突變（E622R、R625D、H662D、K666E、K741E、G742D 和 D781 G）均對其與 WT PRP5 的相互作用產生負面影響。因此，這些 SF3B1 的突變影響了在酵母和人類中與 PRP5 的結合。與 RNA 通道中的突變相比，SF3B1 的 HR10-HR12 中的突變（影響與 PRP5-α1 的界面）對 SF3B1-PRP5 相互作用沒有影響。這一結果支持 PRP5 的 acidic loop 的主導作用。總之，SF3B1 的癌症源性突變損害了其與 PRP5 的結合，並且進一步影響了 BS 校對，進而引發剪接異常，導致疾病的發生。
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總結
在該研究中，報告了人源 17S U2 snRNP 複合物和剪接體 pre-A 複合物的高解析度結構，揭示了剪接體進行分支位點選擇、校正的分子機制。
PRP5 主要通過其 acidic loop 佔據了 SF3B1 的 RNA 通道而錨定在 17S U2 snRNP 上，PRP5 的解旋酶結構域與 U2 snRNA 結合，U2 snRNA 的 BSL 被 TAT-SF1 遮蔽，無法與 BS 發生相互作用。在 pre-A 複合體中，形成一個初始的 U2-BS 雙工，PRP5 的解旋酶結構域與 U2 snRNA 保持在一起，acidic loop 仍然佔據 RNA 通道。此外，SF3B1 的癌症源性突變損害了其與 PRP5 的關聯，從而影響 BS 校對。
綜上，這些發現為剪切體的早期組裝以及由 PRP5 介導的 BS 選擇或校對過程提供了關鍵見解。
題圖來源：站酷海洛
參考文獻：
Zhang, X., Zhan, X., Bian, T. et al. Structural insights into branch site proofreading by human spliceosome. Nat Struct Mol Biol (2024). https://doi.org/10.1038/s41594-023-01188-0