近年來，人類多能間充質幹細胞（hMSC）的研究數量呈指數級增長，MSC 根據其來源組織可分為成人細胞和胎兒細胞。成人 MSC 主要源自骨髓（BMMSC）和脂肪組織（ADMSC），而胎兒 MSC 源自羊水（AFC）、臍帶血（CBMSC）或血管周圍室（PVC）或臍帶華通氏膠（WJMSC）。
MSC 研究中最重要的問題是來自不同組織來源、不同年齡供體的 MSC 之間的異質性，以及供體之間和內部的變異性；此外，MSC 的體外培養條件對其行為和功能特徵也有著重要的影響。
2006 年國際細胞療法間充質與組織幹細胞委員會（The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy）定義了鑑定 MSC 的最低標準：
1
MSC 在標準培養條件下呈貼壁生長；
2
MSC 表達 CD105、CD73 和 CD90，不表達 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19 和 HLA-DR；
3
MSC 在體外必須具有成骨、成脂和成軟骨分化潛能。
如何進行 MSC 的體外培養
MSC 分離是體外培養及擴增的關鍵一步，MSC 的異質性導致了不同的分離方式。不同組織來源的 MSC 通過多種方法進行分離，包括機械分離、粘附培養和細胞爬出的方式等[1]。
不同組織來源的 MSC 培養體系是不同的，MSC 體外培養的關鍵點主要在培養基，培養載體和氧分壓三個方面。
培養基：
含血清培養基已被廣泛用於再生醫學產品的基礎研究和生產。然而，血清存在感染病毒的潛在風險，並增加了細胞培養過程中的大量變異性。為了克服這些問題，科學家們開發出了無血清培養基。此外，在日本，用於生產再生醫學產品的細胞培養基必須符合日本法規「生物成分標準」，其目的就是確保產品的質量、有效性和安全性。
培養載體：MSC 是一種貼壁培養的細胞，基於 2D 培養環境，一般需要基質蛋白包被處理，可供選擇的基質蛋白也有多種，如MatrIS F（31001，FUJIFILM Irvine Scientific）、Fibronectin（31002，FUJIFILM Irvine Scientific）等。基於 3D 培養環境，需要微載體培養貼壁細胞進行附著和生長，之後可進行大規模的 MSC 擴增。不同特性的微載體附著力不同，配合不同的反應器可進行擴增培養參數的調控。
氧分壓：在生理上，MSC 適合低氧分壓的環境生長，氧氣濃度的增加會加速細胞的生理老化進程[2]。低氧對 MSC 的增殖是有促進作用的，並且對細胞分裂也有一定的影響。
文獻解讀：臍帶來源的 MSC 在 PAD（外周動脈疾病）中的組織再生應用[3]
背景：在這項研究中，作者評估了臍帶間質細胞（UCMSCs）的組織再生潛力，並在已建立的缺血大鼠模型中驗證了可作為一種可靠的細胞來源。
間充質幹細胞（MSCs）具有很好的免疫調節功能，並且異體的間充質幹細胞可以安全使用，不會引起明顯的免疫反應。臍帶間充質幹細胞來自於胎兒組織，具有很高的增殖能力。此外，間充質幹細胞的特性會隨著培養條件的不同而改變。因此，理想的培養條件將有助於產生具有高增殖能力和分泌各種細胞因子效力的間充質幹細胞並加強組織再生。
目的：通過一個已建立的缺血大鼠模型來評估靜脈注射 UCMSCs 後的組織再生潛力。
材料方法：
UCMSCs 來源：臍帶取自 2 個在妊娠 40 周時分娩的嬰兒。妊娠 40 周，無併發症。
方法：收集人的臍帶（重量為 2～3 克），臍帶用 A 型膠原酶（Worthington）進行酶解。
培養基 + 基質蛋白：PRIME-XV MSC Expansion XSFM medium（FUJIFILM Irvine Scientific，Santa Ana，CA，USA) +iMatrix-511 laminin（FUJIFILM Wako）
文章詳解：
首先對含或不含層粘連蛋白（iMatrix-511 laminin）塗層的方瓶進行細胞培養效果的評價，為了建立一個實際臨床使用的批量培養系統，文中比較了使用或不使用 iMatrix-511 層粘連蛋白的方瓶中 UCMSCs 的細胞增殖效果。將低溫保存的 UCMSCs 從主細胞庫中解凍，並以 1000 cells/cm2的密度接種於 T512 培養容器中，使用無血清培養基進行培養，評估了含或不含 iMatrix-511 層粘連蛋白塗層間培養效果的差異。
UCMSCs 的建立方案如下：收集人的臍帶（重量為 2～3 克），臍帶用A型膠原酶（Worthington）進行酶解。37°C 酶解 180 分鐘後用 10 倍體積的磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）稀釋。然後用一個 100 微米的 Falcon 細胞過濾器過濾細胞懸液。處理後的臍帶細胞在 37°C（5% 二氧化碳）的PRIME-XV MSC Expansion XSFM 培養基（FUJIFILM Irvine Scientific，Santa Ana，CA，USA）中培養，直到原始培養物達到匯合。使用 TrypLE Select 將匯合的細胞分離出來，並在新的 T150 方瓶（康寧）中培養細胞直到培養至匯合，然後冷凍保存（圖 1A）。
圖 1. 臍帶間充質細胞（UCMSCs）的建立和表徵檢測
（A）建立 UCMSCs 的方案。（B）用藻紅素結合的 CD73、CD90、人類白細胞抗原（HLA）-ABC 和 CD105 抗體染色的 UCMSCs 的代表圖像、 人類白細胞抗原（HLA）-ABC，和 CD105。BF，明視野。（C）評估細胞表面標誌物，使用 2 個不同品系的 UCMSCs（批次 A 和 B）。數值顯示每個表面標誌物陽性的細胞的百分比。
在常氧和低氧條件下，與 UCMSCs 共培養後，衛星細胞數量顯著增加，表明 UCMSCs 在體外誘導肌肉增殖的能力（圖 2.A）。
圖 2. 臍帶間充質細胞（UCMSC）給藥誘導的肌肉再生
（A）UCMSCs 與衛星細胞共培養，在常氧或低氧條件下共培養 48 小時。（B）顯示在常氧和低氧條件下，衛星細胞與 UCMSCs 共培養的增殖率，資料為平均 ± SEM。（C）使用 UCMSCs、培養基或生理鹽水後，蘇木精-伊染色的缺血肌肉的表徵圖像。（D）UCMSCs、培養基或生理鹽水組的肌纖維面積，資料為平均 ± SEM。
在接種了 5 × 105個細胞的方瓶中，UCMSCs 的數量明顯增加。在傳代後的第 5 天和第 10 天，塗有層粘連蛋白的方瓶中 UCMSCs 的數量顯著增加（圖 3.A）。在第 8 代（P8），BMMSCs 停止增殖，而 UCMSCs 和 ADMSCs 則繼續增殖。UCMSCs 的增殖率明顯高於 ADMSCs 的增殖率，表明 UCMSCs 的增殖能力更好（圖 3.B）。
圖 3. 臍帶間充質細胞（UCMSC）的增殖能力
（A）在 iMatrix-511 層粘連蛋白塗層方瓶（iMatrix511）和無塗層方瓶（對照）中培養的 UCMSCs 在第 0、5、10 和 15 天后的增殖差異。每個方瓶中播種 5 × 105個細胞（各 3 個平行）。（B）3 種間充質幹細胞（MSCs）的增殖率，即 UCMSCs、脂肪組織來源的 MSCs（ADMSCs）和骨髓間充質幹細胞（BMMSCs），它們在層粘連蛋白包被的培養瓶中培養。從第 4 代（P）開始，定義為第 0 天，每 10 天進行一次傳代，並在第 0、10（P5）、20（P6）、30（P7）、40（P8）和 50（P9）天繪製細胞總數。BMMSCs 在第 8 天停止增殖，並終止培養。
與 ADMSCs 和 BMMSCs 相比，UCMSCs 分泌的 HGF、MCP-1 和 TGF-β1 的濃度明顯更高（圖 4.A）。
圖 4. 使用 ELISA 進行評估臍帶來源的間充質細胞（UCMSCs；n = 6）、脂肪組織來源的間充質細胞（ADMSCs；n = 6）和骨髓來源的間充質細胞（BMMSCs；n = 4）之間細胞因子產生的差異
HGF，肝細胞生長因子；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1；TGF-β1，轉化生長因子-β1。
結論：本研究使用的方法收穫和培養的 UCMSCs 在非急性、已建立的後肢缺血模型中顯示出很高的再生能力。與來自脂肪組織和骨髓的間充質幹細胞相比，臍帶來源的間充質幹細胞增殖能力較高，考慮到其較高的增殖能力，臍帶將是一個理想的間充質幹細胞來源。
想要 MSC 養的好，優秀培養基少不了
無論是作為細胞治療產品還是藥物遞送載體，間充質幹細胞一直以來都是一個研究熱點。MSC 的多向分化潛能和免疫調節特性使其應用極其廣泛，在滿足大規模臨床需求的情況下，需嚴格把控體外理想的培養環境。
無血清的間充質幹細胞培養基越來越成為主要選擇之一，富士膠片歐文科技的PRIME-XV MSC Expansion XSFM medium為 MSC 的分離、擴增和三系分化提供了一個化學成分限定、無血清和無異源成分的培養體系，同時也有用於促細胞貼壁的基質蛋白，用於冷凍保存的試劑。
PRIME-XV 為何能脫穎而出
PRIME-XV MSC Expansion XSFM培養基旨在支持 hMSC 的高效擴增，同時保留其形態、標記物表達、免疫抑制功能和多次傳代的分化潛能。
PRIME-XV Fibronectin 人血漿源性纖連蛋白旨在支持 MSC 和其他人類細胞類型的細胞粘附和擴散；
左圖：人骨髓來源的 MSC在PRIME-XV 人纖維連接蛋白包被的組織培養級平板中培養 5 天。細胞在 PRIME-XV MSC Expansion XSFM 中培養。以 6000 cells/cm2鋪板。在 10X 放大倍率下拍攝圖像。
PRIME-XV MSC Expansion XSFM 搭配重組包被底物 PRIME-XV Matris F 重組人基質蛋白，讓無血清條件下貼壁細胞生長得更好。
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FUJIFILM Irvine Scientific 是生命科學和醫療市場細胞培養解決方案創新和製造的高科技公司，幫助客戶推進醫療健康計劃。公司橫跨發現研究、細胞和基因治療、生殖醫學和細胞遺傳學，以及生物療法和疫苗的大規模生產，受到研究人員、製造商和臨床醫生的信任。50 多年來，我們的使命始終是為產品和定製化解決方案制定嚴格的質控標準。工廠遵守 ISO 和 FDA 的規定，在美國、日本和荷蘭的生產設施遵循 cGMP 標準，在中國蘇州擁有培養基最佳化中心（創新合作中心，ICC）。所有工廠都優先考慮遵循富士膠片集團「可持續價值計劃 2030」的戰略，以實現可持續增長。富士膠片歐文科技是 FUJIFILM Holdings America Corporation（富士膠片美國）的子公司，隸屬於富士膠片集團。
內容審核：鄒禮平
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參考文獻
[1] Yang Y, et al. Isolation and Culture of Three Kinds of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells. J Vis Exp. 2022 Aug 23;(186).
[2] Pouikli A, et al. Hypoxia promotes osteogenesis by facilitating acetyl-CoA-mediated mitochondrial-nuclear communication. EMBO J. 2022 Dec 1;41(23):e111239.
[3] Miyake K, et al. Regenerative Effect of Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stromal Cells in a Rat Model of Established Limb Ischemia. Circ J. 2023 Feb 24;87(3):412-420.